观察川芎嗪和阿魏酸配伍对PC12糖氧剥夺损伤的预保护作用

时间:2018-09-10 作者:博学论文网
  摘要:目的 观察川芎嗪和阿魏酸配伍对PC12糖氧剥夺 (OGD) 损伤的预保护作用, 优化配比组合。方法 体外培养PC12, 考虑A (是否OGD造模) 、B (川芎嗪0.5、1.0、2.0μmol/L) 及C (阿魏酸5、10、20μmol/L) 3个因素, 采用完全随机分组的2×3×3析因设计。倒置相差显微镜观察造模前后细胞形态;MTS测细胞活力;采用乳酸脱氢酶 (LDH) 法测定细胞损伤, 并进行析因分析。结果 与对照组比较, 模型组细胞变圆或肿胀, 突起回缩或消失, 细胞膜褶皱或破损, 胞体折光性差, 细胞数目明显减少, 细胞活力降低;与模型组比较, 加药组细胞损伤得到不同程度的改善, 细胞活力增加, 川芎嗪2μmol/L+阿魏酸20μmol/L改善作用最明显。A、B、C 3因素均对LDH值具有显着影响 (P<0.01) , 且B、C间存在交互作用 (P<0.01) , 以川芎嗪2μmol/L、阿魏酸20μmol/L配比时, LDH值最低。结论 川芎嗪与阿魏酸合用对PC12剥夺糖氧损伤具有预保护作用, 川芎嗪与阿魏酸配比具有交互作用, 最佳配比为2∶20.
  
  关键词:川芎嗪; 阿魏酸; PC12细胞; 析因分析;
  
  脑卒中是当今世界引起死亡的疾病之一, 该病在2012年世界死亡人数已达到6 671万人, 在所有疾病死亡中占了11.9%, 其中, 缺血性脑卒中大约占80%[1].川芎-当归是治疗缺血性脑血管病的常用药对[2], 川芎, 性温味辛, 具有祛风行气, 活血止痛的功效;当归, 性温味甘辛, 具有补血和血、调经止痛、润肠通便之功效[3].两药伍用共奏养血活血、化瘀通络之效。通过对川芎、当归有效成分进行药理研究发现, 川芎嗪、阿魏酸等均在脑损伤病理机制的不同环节产生效应。如川芎嗪可透过血脑屏障, 抑制钙超载、减少细胞凋亡基因表达、抑制血小板凝集、抑制炎症反应等[4];阿魏酸可抑制炎症反应、清除自由基、抗血栓等[5].二者配比是否有交互作用尚不明确。因此, 本实验采用析因设计, 从抗细胞损伤方面探讨阿魏酸与川芎嗪配伍对PC12氧糖剥夺 (oxygen-glucose deprivation, OGD) 模型预保护的交互作用及最优配比组合。
  
  1 材料
  
  1.1 药物及主要试剂
  
  川芎嗪 (Solarbio, 批号ST8120) ;阿魏酸 (Solarbio, 批号SF8030) ;胰蛋白酶 (Gibco公司, 批号25200) ;DMEM高糖培养基 (Hy Clone, 批号AC10231031) ;胎牛血清 (货号04-001-1ACS, 批号1729601, Gibco) ;无糖培基 (Gibco, 批号1868979) ;0.25%胰蛋白酶、青霉素和链霉素混合液 (Hy Clone, 批号J160021) ;MTS试剂盒 (Promega, 批号0000251174) ;乳酸脱氢酶 (LDH) 试剂盒 (南京建成生物研究工程所) .
  
  1.2 细胞
  
  大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞 (高分化;PC12) , 购自武汉博士德生物科技有限公司, 批号CX0247.
  
  1.3 仪器
  
  倒置相差显微镜 (日本Olympus公司) ;DL-CJ-2NDI超净工作台 (北京东联哈尔仪器制造有限公司) ;Hera cell 150i型CO2恒温孵育箱 (德国Thermo公司) ;TDZ4-WS台式低速离心机 (湖南湘仪仪器有限公司) ;BGZ-240型电热恒温鼓风干燥箱 (上海博迅实业有限公司医疗设备厂) ;立式压力蒸气灭菌器 (上海博迅实业有限公司医疗设备厂) .
  
  2 方法
  
  2.1 PC12细胞的培养
  
  PC12细胞经复苏后, 用含10%胎牛血清的DMEM培养基, 放置37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中进行培养。当细胞覆盖瓶底面积达80%时, 倒掉培养液, 用PBS轻轻荡洗1次, 加入浓度为0.25%的胰蛋白酶液, 消化1~2 min离心, 用完全培养基重悬, 以1×105/m L接种于96孔中, 置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱内培养。24 h后细胞贴壁, 吸弃全部完全培养基并加入相应药物配比培基。
  
  2.2 实验设计
  
  本实验采用完全随机分组3因素多水平析因设计全面考察造模与否、阿魏酸 (高、中、低剂量) 、川芎嗪 (高、中、低剂量) 对PC12损伤的预保护作用。具体为: (1) 是否造模:造模则药物同步处理OGD 12 h (A1) ;不造模则不作OGD处理 (A2) ; (2) 阿魏酸:终浓度分别为5、10、20μmol/L (B1、B2、B3) ; (3) 川芎嗪:终浓度分别为0.5、1.0、2.0μmol/L (C1、C2、C3) , 药物剂量的设定依据预实验的EC50值。
  
  2.3 分组、给药设计
  
  实验分为3组:对照组加入高糖培养基, 正常培养12 h;OGD模型组加入无糖培养基, 置于5%CO2和95%N2和1%O2的37℃三气培养箱中培养12 h;模型加药组的设计:两种药物交叉组合B1C1、B1C2、B1C3、B2C1、B2C2、B2C3、B3C1、B3C2、B3C3共9个加药组, 用无糖培养基配比, 放入37℃含5%CO2、94%N2和1%O2的培养箱内培养12 h.每组重复3次。
  
  2.4 标本采集与检测
  
  取造模前后的PC12于显微镜下进行形态学观察。提取处理后的细胞上清, 采用LDH法测细胞活力。用MTS法检测细胞增殖, 在96孔板培养体系中加入20μL试剂 (每孔100μL完全培养基) ;置于37℃、5%CO2环境下孵育4 h;490 nm处读取吸光度 (A) 值并计算细胞活力。
  
  细胞活力=A给药/模型/A对照
  
  2.5 统计分析
  
  数值采用?±s表示, 运用SPSS 17.0统计软件进行统计分析, 首先对各因素间进行方差齐性检验, 方差齐则进行析因分析统计分析, 若方差不齐, 将数据变换之后再进行统计分析。
  
  3 结果
  
  3.1 倒置显微镜观察PC12细胞形态变化
  
  对照组PC12细胞贴壁生长, 细胞膜光滑且完整, 胞体折光性较强, 细胞伸出单个或多个突起, 突起之间交织成网状;与对照组比较, 模型组细胞变圆或肿胀, 突起回缩或消失, 细胞膜褶皱或破损, 胞体折光性差, 细胞数目明显减少;与模型组比较, 加药组细胞损伤得到不同程度的改善, 川芎嗪2μmol/L+阿魏酸20μmol/L改善作用最明显。见图1.
  
  图1 PC12细胞造模前后形态对比Fig.1 Morphological change of PC12 cells before and after model establishment

  
  3.2 析因设计各组LDH活性比较及MTS法检测各组PC12细胞存活率
  
  2×3×3析因设计各组LDH活性比较及MTS法检测各组PC12细胞存活率, 见表1.结果表明, 同等剂量川芎嗪配伍, 随着阿魏酸的剂量增加, 细胞存活率明显提高, LDH值与细胞存活率成反比;同等剂量阿魏酸配伍, 随着川芎嗪剂量的增加, 细胞存活率明显提高, LDH值与细胞存活率成反比。川芎嗪与阿魏酸合用对PC12糖氧剥夺损伤具有预保护作用。
  
  3.3 方差分析结果
  
  结果表明是否造模、川芎嗪及阿魏酸不同剂量配比均对LDH值具有极显着影响 (P<0.01) .见表2.进一步采用LSD法进行多重比较, 结果显示川芎嗪低、中, 高、低, 中、高剂量间对LDH值的影响具有统计学意义 (P<0.01) ;阿魏酸低、中, 中、高, 高、低剂量间对LDH值的影响具有统计学意义 (P<0.01) , 不同剂量的川芎嗪及阿魏酸之间具有交互作用, 川芎嗪2?mol/L, 阿魏酸20?mol/L时, LDH值最低, 川芎嗪与阿魏酸的最佳配比为2∶20.见表3~4.
  
  表1 各组LDH活性及细胞存活率比较Table 1 Comparison of LDH and cell survival rate in each group

  
  表2 析因设计的方差分析Table 2 Analysis of variance of factorial design

  
  R2=0.957 (校正R2=0.950) R2=0.957 (corrected R2=0.950)
  
  表3 川芎嗪及阿魏酸不同剂量对PC12 LDH值的单独效应 (LSD多重比较结果) Table 3 Separate effects of different doses of TMP and FA on LDH values of PC12 cells (LSD multiple comparison results)

  
  *P<0.05
  
  表4 不同剂量间川芎嗪与阿魏酸对体外培养的PC12 LDH值的交互作用Table 4 Interaction between different doses of TMP and FA on LDH values of PC12 cells in vitro

  
  4 讨论
  
  缺血性脑卒中属于中医学“中风”“卒中”等范畴, 尽管其病机变化多端, 但瘀阻脑络贯穿脑缺血损伤的始末, 应用活血化瘀药常可收到不同程度的治疗效果。当归甘辛性温, 质润, 具有养血活血之效。川芎辛温而燥, 善于行走, 既活血化瘀又行气祛风。二者是中医常用药对, 如《普济本事方》中的佛手散和芎归汤就是当归川芎两味药配伍组成。该对药亦常用于治疗缺血性脑血管疾病。川芎嗪是川芎的有效成分之一, 可透过血脑屏障, 抑制钙超载、减少细胞凋亡基因表达、抑制炎症反应等。实验研究发现, 川芎嗪在大鼠局灶性脑缺血模型中对神经元具有神经保护作用, 并减轻大脑缺血再灌注损伤[6].川芎嗪保护大脑的机制可能与其减少神经递质释放, 抑制中性粒细胞激活, 促进大脑内皮细胞增殖有关[7-9].阿魏酸是川芎和当归的主要水溶性成分, 具有减少自由基、抑制炎症反应、削弱细胞凋亡等作用。在脑缺血和再灌注损伤后, 阿魏酸可防止氧化应激引起的细胞凋亡, 对大脑缺血具有神经保护作用[10-11].通过检测川芎-当归配伍后煎出物成分的改变, 发现没有新的峰出现, 但阿魏酸的含量存在不同程度的增加, 由此推测阿魏酸可能是川芎-当归配伍增效的物质基础之一[12-13].川芎嗪和阿魏酸具有生物利用性低, 代谢快, 半衰期短等特点。有实验证明, 与单独用药比较, 川芎嗪和阿魏酸合用半衰期和平均驻留时间均延长[14-15].因此优化川芎嗪和阿魏酸的生物利用性, 以增强其治疗效果, 对于临床药物的应用至关重要。
  
  本实验以PC12细胞为实验对象, 模拟神经元体外缺氧缺糖模型, 缺氧缺糖的同时给予药物预处理, 探讨阿魏酸与川芎嗪配伍对PC12 OGD模型损伤的预保护的交互作用及最优配比组合。本实验研究发现:与对照组比较, 缺氧缺糖使PC12细胞存活率减少、LDH漏出率增加。与OGD模型组比较, 给予药物干预后, PC12细胞存活率增加、LDH漏出减少, 减轻了OGD引起的细胞损伤。表明川芎嗪阿魏酸配伍对PC12缺氧缺糖具有预保护作用, 提高细胞活性, 减少细胞损伤, 从而发挥神经保护作用。本研究证实, 川芎嗪与阿魏酸配比具有交互作用。同等剂量川芎嗪配伍, 随着阿魏酸的剂量增加, 细胞存活率明显提高;同等剂量阿魏酸配伍, 随着川芎嗪剂量的增加, 细胞存活率明显提高, 最佳配比为2∶20.
  
  本研究通过阿魏酸和川芎嗪的配比应用, 提高了二者的生物利用性, 有助于药对的基础研究以及当归-川芎药对为主的新药开发。但二者的药效物质基础和作用机制还需进一步的实验研究。
  
  参考文献
  
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