两种铁皮石斛中黄酮苷成分的提取分离及其结构鉴定

时间:2018-09-29 作者:博学论文网
  摘要:目的:对2个道地种源(丹霞种、云南广南种)铁皮石斛中的黄酮苷成分进行提取分离、纯化及结构鉴定,为确认铁皮石斛的共性黄酮苷成分提供实验依据。方法:(1)采用70%乙醇提取两个产地铁皮石斛叶的总黄酮成分,依次采用有机溶剂石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取粗提物,运用大孔吸附树脂AB-8,LH-20羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)以及ODS柱色谱对水饱和正丁醇萃取部位进行分离纯化,通过化合物的理化性质结合HPLC,ESI-MSn,1H-NMR,1C-NMR等现代波谱学方法鉴定黄酮苷结构。(2)利用HPLC分析比较不同道地种源(丹霞种、云南广南种、广西铁皮兰种、浙江本地种)铁皮石斛的黄酮苷共有成分。结果:从2个产地铁皮石斛叶中共分离得到了5个黄酮苷化合物,经鉴定为芦丁,新西兰牡荆苷Ⅱ,新西兰牡荆苷Ⅰ,佛莱心苷,异佛莱心苷。4个不同道地种源(丹霞种、云南广南种、广西铁皮兰种、浙江本地种)铁皮石斛茎中均能检出新西兰牡荆苷Ⅱ,新西兰牡荆苷Ⅰ特征峰,其中新西兰牡荆苷Ⅱ丰度相对较大,而佛莱心苷、异佛莱心苷在云南广南种、广西铁皮兰种中出峰明显,芦丁则在丹霞种中尤为突出。结论:新西兰牡荆苷Ⅱ为铁皮石斛不同道地种源(丹霞种、云南广南种、广西铁皮兰种、浙江本地种)的共性黄酮苷成分,可作为铁皮石斛特征图谱的参照物。
  
  关键词:铁皮石斛; 黄酮苷; 芦丁; 新西兰牡荆苷Ⅱ; 新西兰牡荆苷Ⅰ; 佛莱心苷; 异佛莱心苷;
  
  铁皮石斛Dendrobium officinale为中国传统名贵中药,味甘、微寒,常用于热病津伤,口干烦渴,胃阴不足,食少干呕,病后虚热不退,阴虚火旺,骨蒸劳热,目暗不明,筋骨痿软[1].研究表明,铁皮石斛中含有多糖、黄酮类物质、联苄类和菲酚类成分、氨基酸和微量元素等成分[2].其中,黄酮类成分具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖等药理作用[3],而关于铁皮石斛黄酮类成分研究的报道较少,侧重于铁皮石斛中黄酮类成分的含量测定及活性评价,还有部分研究详细报道了黄酮类成分的化学结构,如管惠娟等[4]从铁皮石斛茎水提物的乙酸乙酯和正丁醇萃取部位分离得到19个化合物,其中9个为黄酮类化合物;李燕等[5]从铁皮石斛脂溶性部位分离得到17个化合物,其中有2个二氢黄酮类化合物。但仅仅从这些报道的已知化合物中,还不足以发现它们与不同种源铁皮石斛之间有何关联。
  
  近年来,HPLC指纹图谱技术已经广泛应用于中药化学成分的质量分析,而铁皮石斛种源众多,质量不一,如安徽、广东、广西、浙江、福建、云南等地均有分布,为铁皮石斛的质量评价增加了难度,但同属不同产地中药的化学成分具有一定的相似性,可通过HPLC指纹图谱技术全面评价其质量体系,因此现在急需找到不同种源铁皮石斛的一种或几种共性成分。课题组前期基于本草考证、野外实地考查及对不同产地样品进行HPLC特征指纹图谱研究,提出铁皮石斛道地种源有“丹霞铁皮种”“浙江本地种”“铁皮兰种”等[6].叶子等[7]从铁皮石斛中分离得到专属性黄酮类成分佛莱心苷,但本课题组近年对不同道地种源铁皮石斛黄酮类成分开展了系统研究,发现佛莱心苷在广西“铁皮兰种”和“云南广南种”中含量较高,在“丹霞铁皮种”和“浙江本地种”中含量较低或难以检出[8].故本研究选择两种代表性种源(丹霞种、云南广南种)的黄酮苷类成分进行提取分离、纯化和结构鉴定,得到5个黄酮苷成分,并且在前期特征图谱分析的基础上[6,9],进一步分析比较4个不同道地种源(丹霞种、云南广南种、广西铁皮兰种、浙江本地种)铁皮石斛中黄酮苷成分的共性与个性,最后确认新西兰牡荆苷Ⅱ为共性特征成分,可为铁皮石斛的特征图谱分析提供重要的实验依据。
  
  1 材料
  
  TSQ Quantum Ultra型三重四级杆液相色谱-质谱联用仪(赛默菲);AVANCE III HD 500型超导脉冲傅里叶变换核磁共振谱仪(德国Bruker);HP1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司,包括DAD检测器);MS 204型1/1万电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)。
  
  用于提取分离的新鲜丹霞种铁皮石斛叶(购自广东仁化县鑫宇生态开发有限公司,批号20140501),新鲜云南广南种铁皮石斛叶(购自于云南省保山市龙陵县金石石斛种植园,批号20140409),经广州中医药大学新药开发研究中心魏刚研究员鉴定为兰科植物铁皮石斛Dendrobium officinale的叶;用于特征图谱分析的4批铁皮石斛茎,包括丹霞种,来源于广东仁化鑫宇生态开发有限公司;云南广南种,来源于云南省保山市龙陵县金石石斛种植园;广西铁皮兰种,来源于广西桂平仙宝园铁皮石斛有限责任公司;浙江本地种,来源于浙江天皇药业有限公司,经广州中医药大学新药开发研究中心魏刚研究员鉴定为兰科植物铁皮石斛D.officinale的新鲜茎,鲜品均在60℃条件下减压烘干,备用。
  
  用于特征图谱分析用的芦丁(批号100080-201408,纯度≥90.2%),夏佛塔苷(批号111912-201302,纯度≥92.5%),均购自中国食品药品检定研究院;异夏佛塔苷(批号121024,纯度≥99%),购自上海融禾医药科技发展有限公司;新西兰牡荆苷Ⅱ,新西兰牡荆苷Ⅰ,佛莱心苷,异佛莱心苷为本研究提取分离获得的单体,经峰面积归一化法计算,纯度均供含量测定用。
  
  AB-8大孔吸附树脂(广州市皖业化工有限公司);ODS-A填料(50μm,天津波鸿树脂科技有限公司);LH-20型羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20,Pharmacia公司)。乙腈(色谱纯,德国Merk公司);甲醇(色谱纯,德国Merk公司);四氢呋喃(色谱纯,美国MREDA公司);水为屈臣氏蒸馏水;其他试剂均为分析纯。
  
  2 方法与结果
  
  2.1 丹霞种铁皮石斛叶黄酮苷的提取分离
  
  将干燥的丹霞种铁皮石斛叶粉碎,过1号筛,称取药材粉末2.0 kg,用70%的乙醇回流提取3次,每次2 h,合并提取液,用旋转蒸发仪减压浓缩,得含水浸膏1183.0 g.加适量水溶解,用等体积的石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇溶液依次进行萃取,得到水饱和正丁醇萃取部位总浸膏152.1 g.
  
  取正丁醇层干膏142.1 g进行大孔树脂分离纯化,用水和15%,30%,50%,95%乙醇依次进行洗脱,将30%乙醇洗脱液合并,减压浓缩至一定体积。用50%甲醇溶解浓缩液,上样至Sephadex LH-20色谱柱,50%甲醇等度洗脱,并用HPLC进行检测,合并相同流分,浓缩较纯部分,并用30%甲醇反复重结晶,分离得到化合物芦丁。
  
  将上述经Sephadex LH-20色谱柱纯化的其他相同组分合并浓缩,用20%甲醇溶解,进行ODS色谱分离纯化,以20%,30%,40%,50%甲醇依次洗脱,进行HPLC检测,合并相同部位,30%甲醇洗脱部位经浓缩后反复重结晶得到化合物新西兰牡荆苷Ⅱ,新西兰牡荆苷Ⅰ。
  
  2.2 云南广南种铁皮石斛叶黄酮苷的提取分离
  
  将干燥的云南广南种铁皮石斛叶粉碎,过1号筛,称取药材粗粉4.8 kg,用70%的乙醇回流提取3次,每次2 h.滤过,合并滤液,减压浓缩得浓缩液3 000m L(经换算浸膏量为1 644.0 g),加水稀释成混悬状。用等体积的石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇溶液依次萃取,得到水饱和正丁醇萃取部位总浸膏为258.5 g.
  
  取正丁醇层浸膏244.7 g进行大孔树脂分离纯化,依次用水和10%,20%,30%,50%乙醇依次进行洗脱,将30%乙醇洗脱部位合并,减压浓缩至一定体积,过Sephadex LH-20再次进行分离纯化。用50%甲醇等度洗脱,并用HPLC进行检测,合并相同部位,将较纯部分进行浓缩后,用30%甲醇进行反复重结晶,得到化合物芦丁。
  
  将过完Sephadex LH-20色谱的其他相同部位浓缩,10%乙腈溶解,进行ODS色谱的进一步分离纯化。依次以10%,15%,20%乙腈洗脱,洗脱液进行HPLC检测,合并相同流份,15%乙腈洗脱部分经浓缩后进行反复重结晶,得到化合物新西兰牡荆苷Ⅱ和新西兰牡荆苷Ⅰ。
  
  将过完ODS色谱后的20%乙腈洗脱部分浓缩至一定浓度,进行制备液相分离,PRC-ODS制备柱(4.6 mm×250 mm,7μm),45%甲醇等度洗脱,流速20 m L·min-1,检测波长340 nm.将目标流分合并,浓缩,得到化合物佛莱心苷和异佛莱心苷。
  
  2.3 结构鉴定
  
  芦丁黄色粉末,与盐酸-镁粉反应呈紫红色,推测该化合物为黄酮类化合物;与氨性氯化锶反应出现绿色沉淀,说明有邻二酚羟基;与Molish试剂反应呈阳性,则化合物中接有糖,综合推测化合物可能为黄酮苷类化合物。UV(Me OH)λmax为255,355 nm,进一步推证该化合物为黄酮苷类。ESI-MS m/z 609[M-H]-,则相对分子质量为610,分子式为C27H30O16.其二级碎片离子为m/z 301[(M-H)-Glu-Rha+4H]-,且为基峰,是上级离子失去C12H20O9的碎片离子,表明化合物的C-3位同时连接有两个取代糖。1H-NMR(Me OD-d4,500MHz),δ:ppm 6.20(1H,d,J=2.0 Hz,H-6),6.39(1H,d,J=1.6 Hz,H-8),7.61(1H,m,H-3'),6.86(1H,d,J=8.6 Hz,H-5'),7.62(1H,dd,J=2.1 Hz,H-6'),5.10(1H,d,J=7.3 Hz,H-1“)此为葡萄糖端基上氢的信号,4.51(1H,d,J=1.3 Hz,H-1)此为鼠李糖端基上氢的信号,1.11(3H,d,J=6.5 Hz,H-6)此为鼠李糖CH3上氢的信号。13C-NMR(Me OD-d4,500 MHz)化学位移归属见表1.综合波谱数据与文献[10]对照,该化合物鉴定为芦丁。
  
  表1 芦丁,新西兰牡荆苷Ⅱ,新西兰牡荆苷Ⅰ,佛莱心苷,异佛莱心苷的13C-NMR化学位移(Me OD-d4,500 MHz)


 
  
  新西兰牡荆苷Ⅱ 黄色粉末,与盐酸-镁粉试剂充分反应呈紫红色,提示该化合物为黄酮类化合物。与Molish试剂反应呈阳性,推断为黄酮苷类化合物。UV(Me OH)λmax为271,336 nm,进一步推证该化合物为黄酮苷类。ESI-MS m/z 593[M-H]-,说明其相对分子质量为594,分子式C27H30O15.其二级碎片离子有m/z 503[(M-H)-C3H6O3]-,473[(M-H)-C4H8O4]-,383[(M-H)-C3H6O3-C4H8O4]-,353[(M-H)-C4H8O4-C4H8O4]-,其中473[(M-H)-C4H8O4]-是基峰,为上级离子失去C4H8O4的碎片离子,表明该化合物的C-6位和C-8位取代糖均为六碳糖。1H-NMR(Me OD-d4,500 MHz),δ:6.58(1H,s,H-3),7.92(2H,d,J=8.3 Hz,H-2',H-6‘),6.90(2H,d,J=8.0 Hz,H-3',H-5’),4.92(1H,d,J=9.8 Hz,H-1″)此为葡萄糖端基上氢的信号,5.10(1H,d,J=9.5 Hz,H-1)此为葡萄糖端基上氢的信号。13C-NMR(Me OD-d4,500MHz)化学位移归属见表1.综合数据信息与文献[11-12]对照,该化合物鉴定为新西兰牡荆苷Ⅱ。
  
  新西兰牡荆苷Ⅰ黄色粉末,与镁粉-盐酸反应呈紫红色,推测为黄酮类化合物;与Molish试剂反应出现紫色环,推断可能是黄酮苷类化合物。UV(Me OH)λmax为271,336 nm,推证该化合物为黄酮苷类。ESI-MS m/z 563[M-H]-,相对分子质量为564,分子式C26H28O14.其二级碎片离子有m/z 503[(M-H)-C2H4O2]-,473[(M-H)-C-3H6O3]-,443[(M-H)-C4H8O4],383[(M-H)-C-2H4O2-C4H8O4],353[(M-H)-C3H6O3-C4H8O4]-,其中m/z 473[(M-H)-C3H6O3]-是基峰,为上级离子失去C3H6O3得到的碎片离子,提示化合物的C-6位和C-8位存在五碳糖和六碳糖取代。1H-NMR(Me OD-d4,500 MHz),δ:6.56(1H,s,H-3),7.95(2H,d,J=8.3 Hz,H-2',H-6‘),6.89(2H,d,J=8.0 Hz,H-3',H-5’),4.98(1H,d,J=9.9 Hz,H-1″)此为葡萄糖端基上氢的信号,5.12(1H,d,J=9.7 Hz,H-1)此为葡萄糖端基上氢的信号。13C-NMR(Me OD-d4,500 MHz)化学位移归属见表1.综合波谱数据与文献[13]对照,该化合物鉴定为新西兰牡荆苷Ⅰ。
  
  佛莱心苷 淡黄色粉末,与镁粉-盐酸充分反应呈紫红色,推测该化合物为黄酮类化合物。与Molish试剂反应出现紫色环,推断是黄酮苷类化合物。UV(Me OH)λmax为271,336 nm,进一步推证该化合物为黄酮苷类。ESI-MS m/z 577[M-H]-,推出相对分子质量应该为578,分子式为C27H30O14.其二级碎片离子有m/z 503[(M-H)-C3H6O2]-,487[(M-H)-C3H6O3]-,473[(M-H)-C4H8O3]-,457[(M-H)-C4H8O4]-,413[(M-H)-C3H6O2-C3H6O3]-,383[(M-H)-C3H6O2-C4H8O4]-和383[(M-H)-C3H6O3-C4H8O3]-,353[(M-H)-C4H8O3-C4H8O4]-,其中m/z 457[(M-H)-C4H8O4]-是基峰,为上级离子失去C4H8O4得到的碎片离子,提示化合物的C-6位和C-8位存在六碳糖和五碳糖取代。1H-NMR(Me OD-d4,500 MHz),δ:6.88(1H,s,H-3),7.92(2H,d,J=8.8 Hz,H-2',H-6‘),6.92(2H,d,J=8.8 Hz,H-3',H-5’),5.02(1H,d,J=9.8 Hz,H-1″)此为葡萄糖端基上氢的信号,4.95(1H,s,H-1)此为鼠李糖端基上氢的信号,1.39(3H,d,J=6.0Hz,H-6)此为鼠李糖CH3上氢的信号。13C-NMR(Me OD-d4,500 MHz)化学位移归属见表1.综合波谱数据与文献[14]对照,该化合物鉴定为佛莱心苷。
  
  异佛莱心苷 淡黄色粉末,与镁粉和盐酸反应呈紫红色,推测该化合物为黄酮类化合物。与Molish试剂反应出现紫色环,推断为黄酮苷类化合物。UV(Me OH)λmax为271,336 nm,推证该化合物为黄酮苷类。ESI-MS m/z 577[M-H]-,推出相对分子质量应该为578,分子式为C27H30O14.其二级碎片离子有m/z 503[(M-H)-C3H6O2]-,487[(M-H)-C3H6O3]-,473[(M-H)-C4H8O3]-,457[(M-H)-C4H8O4]-,413[(M-H)-C3H6O2-C3H6O3]-,383[(M-H)-C3H6O2-C4H8O4]-和383[(M-H)-C3H6O3-C4H8O3]-,353[(M-H)-C4H8O3-C4H8O4]-,其中m/z 457[(M-H)-C4H8O4]-是基峰,即为上级离子失去C4H8O4的碎片离子,但与佛莱心苷相比,m/z 503[(M-H)-C3H6O2]-和m/z 473[(M-H)-C-4H8O3]的丰度明显较大,说明化合物的C-6位、C-8位分别有甲基五碳糖和六碳糖取代。1H-NMR(Me OD-d4,500 MHz),δ:6.87(1H,s,H-3),7.92(2H,d,J=8.6 Hz,H-2',H-6‘),6.89(2H,d,J=8.8 Hz,H-3',H-5’),5.02(1H,d,J=10.0 Hz,H-1″)此为葡萄糖端基上氢的信号,4.98(1H,s,H-1)此为鼠李糖端基上氢的信号,1.39(3H,d,J=6.1 Hz,H-6)此为鼠李糖CH3上氢的信号。13C-NMR(Me OD-d4,500 MHz)化学位移归属见表1.综合波谱数据与文献[14]对照,该化合物鉴定为异佛莱心苷。
  
  经过比较分析丹霞种、云南广南种铁皮石斛叶经Sephadex LH-20,ODS色谱分离得到的前3个化合物的1H-NMR,13C-NMR核磁光谱数据信息,发现两个产地的数据基本一致,可以确认丹霞种、云南广南种铁皮石斛中含有相同的组分芦丁,新西兰牡荆苷Ⅱ,新西兰牡荆苷Ⅰ,文中已经对丹霞种铁皮石斛叶中的这3个成分进行了详细的结构鉴定,故不再对云南广南种铁皮石斛中这3个化合物的结构鉴定进行累述。
  
  2.4 四个不同种源铁皮石斛茎黄酮苷成分的HPLC共性与特异性成分分析
  
  2.4.1 色谱条件
  
  按课题组拟定的特征图谱分析方法。采用Kromasil 100-5 C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相四氢呋喃-乙腈-甲醇(10∶22∶5)(A)-0.05%磷酸(B),梯度洗脱;流速1.0 m L·min-1;柱温30℃;检测波长340 nm.
  
  2.4.2 对照品溶液的制备
  
  取芦丁、夏佛塔苷和异夏佛塔苷对照品,以及本研究提取分离获得的单体新西兰牡荆苷Ⅱ,新西兰牡荆苷Ⅰ,佛莱心苷与异佛莱心苷适量,精密称定,加甲醇分别制成每1 m L含新西兰牡荆苷Ⅱ92.5μg,新西兰牡荆苷Ⅰ84.3μg,夏佛塔苷71.4μg,异夏佛塔苷65.3μg,佛莱心苷约70.2μg,异佛莱心苷119.5μg和芦丁165.0μg的对照品溶液。
  
  2.4.3 供试品溶液的制备[6]
  
  取4个种源的铁皮石斛粉末(过60目筛)约2.5 g,精密称定,精密加入80%甲醇125 m L,加热回流4 h,取出,放冷至室温,滤过,用80%甲醇适量洗涤滤渣,合并滤液,挥干溶剂,残渣加80%甲醇使溶解,转移至5 m L量瓶中,加80%甲醇至刻度,摇匀,即得。
  
  2.4.4 特征成分分析
  
  按拟定方法进样分析,鉴别了7个特征峰,其中峰1~峰7分别为新西兰牡荆苷Ⅱ,新西兰牡荆苷Ⅰ,夏佛塔苷,异夏佛塔苷,佛莱心苷,异佛莱心苷,芦丁,结果见图1.研究表明,4个不同道地种源(丹霞种、云南广南种、广西铁皮兰种、浙江本地种)铁皮石斛中均能检出新西兰牡荆苷Ⅱ,新西兰牡荆苷Ⅰ以及丰度差异很大的芦丁特征峰,其中新西兰牡荆苷Ⅱ丰度相对较大,提示新西兰牡荆苷Ⅱ可作为铁皮石斛特征图谱参照物的选择;除云南广南种的夏佛塔苷、异夏佛塔苷特征峰丰度很小外,其他三个种源均检出夏佛塔苷、异夏佛塔苷特征峰;佛莱心苷与异佛莱心苷是云南广南种与广西铁皮兰种特异性特征峰,而且云南广南种的丰度更大;丹霞种的特点是芦丁峰特别显着,而其他产地样品该特征峰明显较小。
  
  图1 4个不同种源铁皮石斛茎的HPLC图谱重叠Fig.1

  
  3 讨论
  
  铁皮石斛作为一种珍稀名贵中药材,正日益受到人们的关注,野生石斛更是濒危灭绝。但随着铁皮石斛栽培行业的发展,铁皮石斛药材不断丰富市场的同时,也面临种源不清、产品质量参差不齐,甚至以假充真的挑战。铁皮石斛现有质量主要以多糖含量及单糖组成进行评价[1],特异性不强,因此不断完善铁皮石斛的质量评价标准至关重要。经文献报道,发现铁皮石斛中含有多种以芹菜素为苷元的黄酮碳类成分[15],可考虑以此作为铁皮石斛质量评价标准的参考。
  
  课题组前期对大量的铁皮石斛道地种源开展了特征图谱分析[6,8],发现既有共性,也有个性;并比较了铁皮石斛茎和叶的黄酮苷成分[9],发现可以利用铁皮石斛叶开展共性黄酮苷的分离,因此本研究在此基础上建立了铁皮石斛黄酮苷成分的制备方法,先后从丹霞种、云南广南种两个代表性种源中共分离得到了5种黄酮苷类成分,分别为芦丁,新西兰牡荆苷Ⅱ,新西兰牡荆苷Ⅰ,佛莱心苷和异佛莱心苷;在分离得到以上单体后,进一步选择前期有分析基础的不同道地种源(丹霞种、浙江本地种、广西铁皮兰种、云南广南种)进行比较,通过HPLC图谱分析上述4个不同道地种源的黄酮苷类成分,得出新西兰牡荆苷Ⅱ,Ⅰ可作为铁皮石斛的共性成分及其质量评价的特征性成分,其中尤其新西兰牡荆苷Ⅱ含量较高、分离度较好,可作为特征图谱的内标物,为进一步完善铁皮石斛的质量评价指标提供了参考依据。同时本研究也存在改进的地方,对铁皮石斛中含量较低的其他未分离的黄酮类化合物可进一步开展提取分离鉴定的研究,并对其药理活性开展评价。
  
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