生脉姜黄散用于鼻咽癌放射治疗的效果

时间:2018-12-06 作者:博学论文网
  摘要:现代药理研究表明,生脉散具有增强免疫力、改善血液循环等功效;姜黄具有抗炎、抗癌、抗氧化等多种作用。生脉散联合姜黄在中药抗肿瘤的研究中是一种崭新的研究方向。目前鼻咽癌的主要治疗手段是放射治疗,但众所周知放射治疗会引起多种副作用,同时也会改变肠道菌群的构成。研究表明,鼻咽癌放疗后机体的病机主要为正虚血瘀,生脉姜黄散体现了中医益气活血养阴的重要治法。该研究用鼻咽癌抗照射细胞株对裸鼠种植移植瘤,然后利用16s rDNA测序平台对服用生脉姜黄散或照射治疗裸鼠的肠道粪便样本进行宏基因测序,之后对肠道菌群数据结果进行分析,探讨生脉姜黄散对肿瘤移植裸鼠肠道菌群结构产生的影响。结果表明,生脉姜黄散联合照射治疗可增强肿瘤治疗的疗效,放射治疗会降低裸鼠肠道菌群的总数与多样性,同时也会改变菌群结构组成。生脉姜黄散可保护菌落的多样性,也能部分恢复因照射引起的菌落失调。该研究为生脉姜黄散作为鼻咽癌放射治疗的增敏辅助用药提供了研究思路。
  
  关键词:生脉姜黄散; 鼻咽癌; 肠道菌群; 放射; 16s rDNA;
  
  鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一种在中国东南部省份的发病率很高的癌症之一[1],目前放射疗法是鼻咽癌的主要治疗手段[2].但是在放射治疗过程中会产生放射抗拒性[3].同时,放射治疗不可避免地会对肿瘤周围的正常组织造成损伤[4].此外,电离辐射也会改变肠道菌群[5],并对肠道产生有害的影响。因此,有效提高放射治疗的敏感性、降低放疗的副作用、保护肠道菌群是增强放疗疗效的关键。
  
  本课题组前期实验证明姜黄[6]、生脉散[7]等可在鼻咽癌细胞中起放射增敏的作用,同时经改良后的生脉姜黄散也在裸鼠体内证明调控细胞周期素依赖性激酶6(CDK6)实现放射增敏[8].本实验旨在通过16s rDNA测序的方法研究生脉姜黄散对放射引起的肠道菌群改变的调理作用,同时也为阐明生脉姜黄散对鼻咽癌放射增敏机制提供新的方向。
  
  1材料
  
  人低分化鼻咽癌细胞株CNE-2(中山大学肿瘤防治中心惠赠);人鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R由本课题组用CNE-2经长期大剂量照射诱导[9];RPMI 1640培养基(美国Gibco公司,批号11875119);胎牛血清FBS(美国Gibco公司,批号10099157);胰蛋白酶(杭州吉诺生物医药技术有限公司,批号GNM-15050)
  
  BALB/c-nu裸鼠,SPF级,4周龄,雄性,体质量(18±3)g,购于中山大学实验动物中心,动物许可证号SCXK(粤)2016-0029,已通过南方医科大学实验动物伦理委员会伦理审查,批号L2017031.裸鼠按随机数字表法随机分成5组,即正常组(A组)、模型组(B组)、生脉姜黄散治疗组(C组)、照射组(D组)、生脉姜黄散联合照射组(E组)。每组3只,分笼饲养。
  
  生脉姜黄散由人参(吉林,批号Y1105027),麦冬(广东和翔制药有限公司,批号HX16F01),五味子(广东天诚中药饮片有限公司,批号160101),姜黄(广东天诚中药饮片有限公司,批号150101),4味中药组成。上述药物经南方医科大学中药鉴定教研室马骥教授鉴定,人参为五加科植物人参Panax ginseng的干燥根,麦冬为百合科植物麦冬Ophiopogon japonicus的干燥块根,五味子为五味子科植物五味子Schisandra chinensis的干燥成熟果实,姜黄为姜科植物姜黄Curcuma longa的根茎。按照“人和动物之间按体表面积折算的等效剂量比值表”以成人正常计量计算出裸鼠等效剂量,即4.29 g·kg-1,常规煎煮,冷却后4 ℃保存。
  
  2方法
  
  2.1细胞培养
  
  在37 ℃,5%CO2的孵育条件下,CNE-2R细胞在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中培养。每天换液,细胞生长到培养瓶70%~80%时用0.25%胰蛋白酶消化传代培养。
  
  2.2移植瘤造模、给药及照射干预
  
  15只BALB/c-nu裸鼠适应性喂养1周,将收集好的对数生长期的CNE-2R细胞株,用无血清培养基调整细胞浓度至5×106个/mL,按相应实验分组接种0.2 mL肿瘤细胞于裸鼠右下大腿皮下。接种后1周成瘤,第8天开始给与相关药物干预。A组、B组、D组给予蒸馏水灌胃,C组和E组给予4.29 g·kg-1生脉姜黄散灌胃,分2次给药,早晚各1次。1周后对D组和E组给与4Gy剂量X线烧伤,吸收剂量率为200 cGy·min-1,2 d一次,共3次照射。
  
  2.3药物疗效观察
  
  每天称重1次,每天测量移植瘤长径与短径。在裸鼠处死前收集各组裸鼠的新鲜粪便,放置-80 ℃冰箱保存(共收集45个样)。无菌剥取移植瘤,测量皮下移植瘤的最大长径(a)和横径(b),计算移植瘤体积(V,mm3)=ab2/2.剥离瘤体称重,并计算肿瘤体积抑制率和抑瘤率。瘤体积抑制率=(1-实验组平均瘤体积/对照组平均瘤体积)×100%,瘤体质量抑瘤率=(1-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100%.
  
  2.4 DNA提取和测序
  
  采用粪便基因组DNA提取试剂盒提取各组小鼠粪便样本中微生物的总DNA.所提取的DNA与-80 ℃冰箱中保存。对样品进行PCR扩展及测序,针对16s rDNA基因V3~V4区,合成带有特异引物,利用338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3‘)和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)2种引物进行PCR扩增并完成测序样本文库构建。按照MiSeq User Guide准备测序试剂,将flow cell放到测序仪上(仪器型号MiSeq,Illumin公司)。选用paired-end程序,进行paired end 2×300 nt multiplex测序。测序过程由Illumina公司提供的data collection software进行控制,并进行实时数据分析。本研究的DNA提取、文库构建、测序以及生物信息服务在上海伯豪生物技术有限公司完成。
  
  2.5数据处理
  
  使用SPSS 21.0软件进行统计学分析。采用配对t检验分析2组样品在不同分类学水平的差异,以P<0.05为差异有统计学意义。
  
  3结果
  
  3.1裸鼠移植瘤体积与质量变化
  
  各组移植瘤的体质变化、肿瘤质量变化见表1.与模型组相比,各处理组肿瘤生长都受到一定程度的抑制,与单纯照射组和单纯中药组相比,生脉姜黄素联合照射组的肿瘤体积抑制率高(P<0.01),表明肿瘤在裸鼠体内的生长受到抑制。
  
  表1 各组裸鼠移植瘤体积的比较

  
  注:A.正常组;B.模型组;C.生脉姜黄散治疗组;D.照射组;E.生脉姜黄散联合照射组(表2,图4,5同)。与B组比较1)P<0.05;与D组比较2)P<0.05.
  
  3.2共有及特有OUT统计分析
  
  通过对原始数据的处理,得到每个样本的OUT总数,见图1,并根据各组之间特有与共有的OUT绘制韦恩图,见图2,可以看出,照射后裸鼠肠道的特有OTU数目降低,生脉姜黄散可以提高特有OTU的数目。
  
  图1 5组样本间OUT数 

  
  图2 5组样本间OUT差异Venn图

  
  3.3物种丰富度分析
  
  alpha多样性通常用于度量群落中物种的丰富度。Shannon指数反应群落的多样性,Ace与Chao指数代表物种总数。照射组的群落多样性与物种总数比造模组与空白组低,生脉姜黄散处理组也会使物种总数下降,但会增加物种的多样性,见表2.
  
  表2 alpha多样性指数分析

  
  beta多样性是对样本间的生物进行PCoA分析,选择可以区分样本的2个最大差异特征为坐标轴,根据散点间距离分析其相似度。图中2个样本之间距离越接近,表明该样本的物种组成越相似。基于unweighted unifrac距离构建坐标系,对稀有物种分析较敏感。结果显示,空白组与造模组距离较近,而照射组与生脉姜黄素联合照射组都离它们较远,中药组与其他4组的距离都较远,见图3a.基于weighted unifrac距离构建坐标系,该分析对高丰富度的物种较敏感。空白组、造模组与中药组距离较近,照射组与生脉姜黄散联合照射组距离较近,与其他3组距离较远,见图3b.
  
  图3 基于unweighted unifrac距离(a)和weighted unifrac距离(b)的PCoA分析

  
  3.5群落结构分析
  
  在门水平上对群落进行分析,其主要构成为Bacteroidetes(拟杆菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)、Proteobacteria(变形杆菌门),其中各组以拟杆菌门所占比例最大,见图4.在各个门水平上部分差异显着的菌落分布见图5,其中,在生脉姜黄散组中拟杆菌门所占比例比其他组低,厚壁菌门占比例比其他组高,在生脉姜黄散联合照射组中,变形杆菌门所占比例比其他组高。在科水平上,生脉姜黄散联合照射组中的S24-7科比其他各种所占比例低,照射组与生脉姜黄散联合照射组中Prevotellaceae(普雷沃氏菌科)比其他组高。这些菌群的变化与照射和生脉姜黄散的给药之间表现出良好的相关性。
  
  图4 裸鼠肠道微生物在门水平的组成



  图5 肠道群落的丰度比较

  
  4讨论
  
  目前临床使用的放射增敏剂或辅助用药主要是铂类[10]、硝基咪唑[11]、环氧化酶-2抑制剂[12]等。然而铂类药物会减少肠道益生菌,使条件致病菌增加[13].中药具有纯天然,副作用小等优点,中药作为放射增敏剂是一种新趋势:如诱导细胞凋亡[14]、抑制细胞周期[8]、抑制巯基化合物生成[15]、诱导自噬[16]等。同时,中药的治疗途径主要以口服为主,药物的有效成分进入肠道后与肠道菌群相互作用。肠道菌群可影响中药的吸收[17,18],中药也可调节肠道菌群的结构组成[19].已有实验证明中药可调节肠道菌群:如枸杞子和黄芪促进双歧杆菌的生长[20]、党参可抑制大肠杆菌[21]等。
  
  人体的健康与肠道内的菌群结构,特别是益生菌群的结构息息相关。肠道菌群在生长进化过程中,不断的受宿主和环境的影响。同时,肠道菌群也会作用于宿主,与宿主形成一个相互依存、相互制约的系统。维持肠道菌群的多样性与稳定性对人体健康有很重要的意义。
  
  实验结果表明,生脉姜黄散联合照射可明显抑制裸鼠移植瘤的生长,这于本课题组既往研究成果相符[8,9],这说明生脉姜黄素可作为一种中药的放射增敏剂。
  
  在肠道菌群结果的分析中,可通过比较分组间OUT获得韦恩图,分析各组特有的群落。alpha多样性分析根据各样本生成的OUT,对样本序列进行随机取样,以取出的序列数及这些序列所能代表的OUT数计算样本的alpha多样性指数。beta多样性分析中,Unifrac分析是利用各样本序列间的进化信息来比较环境样本在特定的进化谱系中是否有显着的微生物群差异。菌群结构分析可对样本中各层次,即门(phylum)、纲(class)、目(order)、科(family)、属(genus)、种(species)层次上的分类结果综合起来比较样本间的物种组成差异。
  
  在本研究中,造模组与空白组之间的多样性差异不大,而造模组的物种总数(Ace=6 790.583,Chao=3 571.711)比空白组小(Ace=8 138.905,Chao=4 001.035)。从组成结构比例上看,造模组的变性杆菌门(Proteobacteria)比空白组少,而普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)较多,这说明移植瘤造模会降低裸鼠肠道菌群的总数,同时也会改变菌群结构。裸鼠在照射后,特有OTU数目降低,同时菌群的多样性(Shannon=3.897 547)与物种总数(Ace=5 498.54,Chao=3 062.436)也同样下降,这说明照射会降低菌群的总数与多样性。生脉姜黄散组与造模组相比,特有性种群数降低,种群总数也降低(Ace=6 040.912,Chao=2 984.21),但多样性增加(Shannon=4.284 884),同时,在Unifrac分析中看出,生脉姜黄散组的菌落结构与造模组、空白组差异较大,主要表现在拟杆菌门(Bacteroidetes)与普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)所占比例较少,而厚壁菌门(Firmicutes)比例较高。这可能是生脉姜黄散会特异激发某些种群生长,使其成为优势菌群,从而抑制其他菌落的生长。有证据表明生脉散能抑制肠杆菌、肠球菌的增殖,促进肠道益生菌乳酸杆菌、梭菌增殖[22].也有研究发现长期服用人参提取物可以引起肠道的双歧杆菌与乳酸杆菌显着上调[23].在生脉姜黄散联合照射组中,特异性种群和种群多样性比照射组有所恢复,而群落总数最少。在Unifrac分析中,联合组的分布也有向造模组回复的趋势。种群组成结构也和造模组相似。同时,在联合组的种群组成结构中,Bacteroidales_S24-7所占比例比其余4组较低,普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)所占比例较高,也出现较高的比例的Verrucomicrobia(疣微菌门)(6.67%~10.83%)。
  
  Bacteroidales_S24-7被报道与IgA相联系,并可能导致结肠炎[24],生脉姜黄散联合照射组可降低S24-7的比例,有效保护肠道菌群的多样性。普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)可降解各种结构性碳水化合物[25],如纤维素、半纤维素、果胶等。在联合组中,较高比例的普雷沃氏菌科可维持裸鼠的体质,增强对射线的耐受力。疣微菌门(Verrucomicrobia)是一门被划出不久的细菌,其功能尚未明确,考虑与甲烷代谢相关[26].
  
  综上所述,本研究通过对鼻咽癌放射抗拒株细胞CNE-2R移植瘤裸鼠肠道菌群分析发现,生脉姜黄散可保护由照射引起的肠道菌群失调,并改变裸鼠肠道营养代谢,增强裸鼠体质,从而部分解释了生脉姜黄散在放射增敏的一些药效作用机制。本研究为进一步探讨鼻咽癌放射增敏的作用及拓展中药研究的新方向奠定了基础。
  
  参考文献
  
  [1]Torre L A, Bray F, Siegel R L, et al. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin,2015,65(2):87.
  [2]Sze H, Blanchard P, Ng W T, et al. Chemotherapy for nasopharyngeal carcinoma--current recommendation and controversies[J]. Hematol Oncol Clin North Am,2015,29(6):1107.  
  [3]Chen W, Hu G H. Biomarkers for enhancing the radiosensitivity of nasopharyngeal carcinoma[J]. Cancer Biol Med,2015,12(1):23.  
  [4]丘文泽,黄培钰,施君理,等。 调强放疗结合诱导化疗或同期加辅助化疗治疗局部晚期鼻咽癌的疗效比较[J]. 中国肿瘤临床,2015,42(4):231.  
  [5]Crawford P A, Gordon J I. Microbial regulation of intestinal radiosensitivity[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(37):13254.  
  [6]Wang Q, Fan H, Liu Y, et al. Curcumin enhances the radiosensitivity in nasopharyngeal carcinoma cells involving the reversal of differentially expressed long non-coding RNAs[J]. Int J Oncol,2014,44(3):858.  
  [7]魏辉,王启瑞,刘英,等。 加味生脉散对气虚型鼻咽癌大鼠的放射增敏作用及相关机制[J]. 中国实验方剂学杂志,2012,18(24):233.  
  [8]黄沐,李爱武,刘钊汝,等。 生脉姜黄散对鼻咽癌CNE-2细胞裸鼠移植瘤的放射增敏作用[J]. 中国实验方剂学杂志,2018,24(6):145.  
  [9]朱道琦,黄沐,刘钊汝,等。 姜黄素对鼻咽癌抗拒株的放射增敏作用及其机制研究[J]. 中国药理学通报,2017,33(8):1086.  
  [10]刘丽,张石川。 铂类在鼻咽癌同步放化疗中的应用[J]. 肿瘤预防与治疗,2017,30(2):136.  
  [11]江曼,钱晓萍,刘宝瑞。 恶性肿瘤放射增敏剂研究进展[J]. 现代肿瘤医学,2014,22(1):226.  
  [12]冉晨曦,何人可,汤小玲,等。 肿瘤放射治疗中辐射增敏剂的应用进展[J]. 山东医药,2015,55(3):86.  
  [13]陈晓慧,李巍,鱼芳,等。 肺癌患者铂类药物化疗后肠道菌群变化的临床研究[J]. 中国微生态学杂志,2016,28(7):781.  
  [14]Veeraraghavan J, Aravindan S, Natarajan M, et al. Neem leaf extract induces radiosensitization in human neuroblastoma xenograft through modulation of apoptotic pathway[J]. Anticancer Res,2011,31(1):161.  
  [15]Jia L, Ma S, Hou X, et al. The synergistic effects of traditional Chinese herbs and radiotherapy for cancer treatment[J]. Oncol Lett,2013,5(5):1439.  
  [16]Thyagarajan A, Jedinak A, Nguyen H, et al. Triterpenes from Ganoderma lucidum induce autophagy in colon cancer through the inhibition of p38 mitogen-activated kinase (p38 MAPK)[J]. Nutr Cancer,2010,62(5):630.  
  [17]姜东京,张丽,曹雨诞,等。 肠道菌群在中药研究中的应用[J]. 中国中药杂志,2016,41(17):3218.  
  [18]安婉丽,李雪丽,孔冉,等。中医药治疗肠道菌群失调症的方剂用药规律分析[J].中国实验方剂学杂志,2018,24(12):210.  
  [19]于岚,邢志凯,米双利,等。 中药对肠道菌群的调节作用[J]. 中国中药杂志,2018.  
  [20]李平兰,时向东,吕燕妮,等。 常见中草药对两种肠道有益菌体外生长的影响[J]. 中国农业大学学报,2003(5):33.  
  [21]王广。 党参多糖对肠道菌群失调小鼠的调整作用机制的初步研究[D]. 佳木斯:佳木斯大学,2010.  
  [22]花海莹,李雪晴,刘吉华。 生脉散对人肠道菌群失衡的调节作用[J]. 中国药科大学学报,2016,47(1):95.  
  [23]孙艺凡,张霞,王晓艳,等。 长期服用人参提取物对大鼠肠道菌群结构的影响[J]. 中国中药杂志,2018,43(19):3927.  
  [24]Palm N W, de Zoete M R, Cullen T W, et al. Immunoglobulin A coating identifies colitogenic bacteria in inflammatory bowel disease[J]. Cell,2014,158(5):1000.  
  [25]Latham E A, Weldon K K, Wickersham T A, et al. Responses in the rumen microbiome of Bos taurus and indicus steers fed a low-quality rice straw diet and supplemented protein[J]. J Anim Sci,2018,96(3):1032.  
  [26]郑勇,郑袁明,张丽梅,等。 极端环境下嗜热酸甲烷营养细菌研究进展[J]. 生态学报,2009,29(7):3864.
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